近几十年以来，我国露天煤矿发展迅速，占全国煤炭产量的比重逐渐增加，主要分布在山西以及内蒙古草原地区，露天煤矿正在向高度集中化、集约化方向发展[1]。由于煤炭露天开采导致地表剥离严重、地下水位下降[2]、产生大量粉尘及有害气体[3]，严重影响地下水、大气、动植物的多样性及稳定性，加速草原地区的盐碱化和沙漠化，进而影响居民健康生活和正常活动。
重金属通常情况下主要以稳定的状态存在于生态环境中，但是由于矿山开采，金属冶炼，存在于土壤中的重金属被剥离到地表，随着大气、水流进入到土壤及水环境中[4-6]，矿区附近的重金属污染非常严重，已经严重危害到附近居民饮食和生活健康，是我国面临重金属污染治理的巨大挑战和难题。
目前对露天煤矿环境治理及生态修复的研究多集中于不同复垦模式的修复效应[7]和排土场绿化[8]，对微生物修复少有报道。赵旭鹏等[9]对矿区土壤微生物多样性的研究显示，开采早期区域的生物多样性较开采晚期区域的低，可见露天开采影响土壤微生物的多样性。在重金属的胁迫下[10-14]，耐受力弱的微生物会迅速减少或灭亡。耐受力强的微生物可以正常存活，微生物不会降解重金属，但是可以富集[15-18]或转移重金属，达到改良土壤的目的。CHON等[19]研究发现微生物在自然条件下，通过提供适当的碳源，在土壤水或地下水运输的过程中，会在固体表面形成生物膜可以有效地吸附重金属，特别是带正电荷的重金属;对于砷等氧化还原敏感的元素，微生物还原三价铁或硫酸盐以及硫化物形成的沉淀可大大降低有毒元素的迁移率。研究表明，植物和微生物均对重金属具有富集或迁移作用。
耐重金属细菌由于对重金属具有交叉抗性[20]，以及对重金属有不同的耐受程度，需要对细菌进行整体的筛选以及尝试不同重金属浓度梯度的检测，以确保数据的真实性和准确性。
本研究以宝日希勒露天煤矿区土壤为研究对象，采用高温高压灭菌法和过膜除菌方法相结合的方法，确保重金属溶液结构不被破坏的前提下，在前人研究[21-24]的基础上利用二价铁、二价锰、二价铜、六价铬对细菌进行分离，最终筛选出优良耐重金属细菌，并对细菌进行耐受力检测以及鉴定，对优良菌株进行保藏，为矿区未来的土地复垦和生态修复提供重要的理论依据和菌种资源。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
宝日希勒露天矿地处呼伦贝尔草原中部，距离呼伦贝尔市中心海拉尔区15 km。矿区坐标为东经119.399°～119.606°，北纬49.323°～49.425°。该地区属于亚寒带大陆性半干旱气候区，年平均气温在-2.6 ℃，年最低温度-48 ℃，年最高温度37.7 ℃，冬季寒冷漫长，夏季凉爽干旱[25]。
1.2 样地选择及样品采集
选取宝日希勒露天矿外草原区为样区，设置采样点。宝日希勒露天矿的开采推进方向为由西向东，随着采挖扩大和推进，矿坑和排土场面积逐渐扩大。矿坑南面受其他因素(道路交通等)干扰严重，而矿坑北面为自然放牧地，受其他因素的扰动较少。因此，本研究选择矿坑北面作为研究区，距离矿坑外围300 m的位置取1条线，从西向东分别设置3个采样点:A(矿坑最西侧，最先开采)，B，C(目前正在开采)。同时取2处参照区，1处为距离露天矿20 km的陈巴尔虎旗检测场(国家级草原固定检测点)，此处是天然草原群落，不受人为和生产活动的干扰，记为W。另1处采样点位于矿区内尚未复垦的排土场，记为K。
在A，B，C，W，K五个样地，每个样地分别取3个1 m×1 m的样方，取0～10 cm土壤各2 kg置于无菌塑封袋中，将每个样地的3份土壤进行混匀，土样在实验室条件下过筛(2 mm)处理，放于4 ℃冰箱冷藏保存备用。
1.3 筛选方法
将牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，冷却至60 ℃，加入过膜除菌后的重金属溶液，倒入平板凝固，制成200 mg/L的Cu2+,Fe2+,Mn2+,Cr6+离子质量浓度为200 mg/L的重金属培养基，将悬菌液进行涂板，24 h后观察。
挑取重金属培养基上的单菌落，置于重金属质量浓度为400 mg/L的培养基中，24 h后观察，以此类推，直到每种重金属培养基只长出1种菌落为止，即为最高耐受菌株。
1.4 菌株生理生化能力检测
将筛选出的菌株进行碳源利用实验、氮源利用试验、淀粉水解试验、酪氨酸水解试验、酪蛋白水解试验、V-P试验和糖发酵试验。
将筛选出对4种重金属耐受力最强的细菌进行生长曲线的测定，配置质量浓度为0，100，200，300 mg/L的重金属液体培养基，每个浓度设置12个重复，将提前摇好的细菌悬浊液取100 μL进行接种，分别在0，2,4，6，8，10，12，14，16，18，20 h取样测OD值(600 nm波长)，绘制细菌的生长曲线。
1.5 菌株的鉴定
菌株采用16s rDNA分子生物学鉴定:挑取单菌落于1.5 mL离心管中，加入细菌通用引物27F(5′—AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG—3′)1 μL，1492R(5′—TACGG CTACC TTACG ACTT—3′)1 μL，加入25 μL 2xTaq PCR Master Mix，23 μL DDH2O，构建50 μL的PCR反应体系，反映条件为高温预变性94 ℃，10 min，变性94 ℃、30 s，退火55 ℃、40 s，延伸72 ℃、1 min，35次循环，后延伸72 ℃、3 min，最后4 ℃永久恒温。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，20 min后进行凝胶成像分析，观察到条带后将PCR产物送至上海生工生物有限公司进行测序。
1.6 数据统计与分析
采用Excel软件对数据进行统计和初步分析;采用IBM SPSS Statistics 20软件对数据进行单因素方差分析，再采用字母标记法，根据 Duncan 多重比较法进行实验数据差异度标记;采用graphpad prism8软件进行图形的制作与处理(所有图片中的误差线均为重复之间的最高值和最低值);采用MEGA7进行进化树的构建。
2 结果与分析
2.1 筛选结果
土壤耐重金属铜、铁、锰、铬的细菌共筛到16株(表1)，其中耐重金属铜共筛到3株，耐重金属铁共筛到3株，耐重金属锰共筛到9株，耐重金属铬共筛到1株。其中3株耐重金属铜的细菌中，有1株的最高耐重金属的质量浓度达到500 mg/L;在3株耐重金属铁的细菌中，有1株的最高耐重金属质量浓度达到500 mg/L;在1株耐重金属铬的细菌的最高耐重金属质量浓度达到200 mg/L。在9株耐重金属锰的细菌中，其中1株的耐重金属质量浓度达到50 g/L，由于重金属质量浓度已到达过膜除菌方法的最大溶解度，这株菌在更高浓度中可能会生长，可能为1种新型的耐重金属锰的菌株。
表1 细菌生理生化反应
Table 1 Physiological and biochemical reactions of bacteria
生理生化反应XCu-1XFe-1XMn-1XCr-1蔗糖碳源+---淀粉碳源++++甘油碳源+---葡萄糖碳源++++(NH4)2SO4氮源+-++KNO3氮源+---淀粉水解试验++++酪蛋白水解试验++++酪氨酸水解试验----V-P试验++++D-葡萄糖产酸试验++++D-葡萄糖产气试验----D-木糖产酸试验----D-甘露糖产酸试验++++L-阿拉伯糖产酸试验----
注:“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2.2 菌株生理生化能力检测
4种耐受菌株对不同碳源利用、不同氮源利用、淀粉水解、酪氨酸水解、酪蛋白水解、V-P试验、糖发酵特性试验结果见表1。
耐重金属铁菌株XFe-1生长曲线如图1所示。在前10 h的培养中细菌处于延缓期，10～16 h处于对数期，16 h后到达稳定期。0 mg/L的细菌生长曲线的斜率大于100，200，300 mg/L的细菌生长曲线，说明重金属Fe2+的加入会抑制细菌的生长，随着Fe2+质量浓度的增大，细菌的受抑制会更明显。并且重金属Fe2+增加到200 mg/L以上时，细菌的受抑制作用相当明显，当质量浓度达到300 mg/L时，可以看到细菌的质量浓度达不到未污染培养基的一半，可见重金属Fe2+质量浓度对细菌的毒性呈对数增长。
图1 耐重金属铁质量浓度梯度细菌生长曲线
Fig.1 Fe2+concentration gradient growth curves
耐重金属铜菌株XCu-1生长曲线如图2所示。在重金属Cu2+的胁迫作用下，0～4 h细菌处于延缓期，细菌状态比较稳定，在4～16 h，细菌的数量成倍的增加，细菌处于对数期，在16 h之后，细菌的数量达到峰值，并且会逐渐减少。由图2可见，当重金属Cu2+的质量浓度为100 mg/L时，细菌的质量浓度比0 mg/L的细菌质量浓度高，并且当Cu2+质量浓度达到200 mg/L的时候，细菌的质量浓度甚至比100 mg/L的质量浓度还要高，但是当Cu2+质量浓度达到300 mg/L时细菌的质量浓度会比之前3个污染梯度低，因此可以断定，重金属Cu2+质量浓度在200 mg/L以内时，重金属Cu2+对细菌的生长起促进作用，细菌质量浓度与重金属Cu2+质量浓度呈正相关，这可能是由于低质量浓度铜下，细菌可以吸附铜离子作为自身的生长因子，但是当重金属Cu2+质量浓度高于200 mg/L时，重金属的毒性超出了细菌耐受的毒性，因此细菌的质量浓度会逐渐降低，细菌质量浓度与重金属Cu2+质量浓度成反比。
图2 耐重金属铜质量浓度梯度细菌生长曲线
Fig.2 Cu2+ concentration gradient growth curves
耐重金属铬细菌XCr-1生长曲线如图3所示。在前8 h内，细菌处于延缓期，在8～16 h内细菌迅速增长，处于对数期，在20 h后细菌数量基本处于平稳状态，细菌进入稳定期，随着重金属Cr6+质量浓度的升高细菌的生长受到抑制，细菌可能受重金属毒性的影响，Cr6+质量浓度越大，细菌的数量越少，且增长缓慢。
图3 耐重金属铬质量浓度梯度细菌生长曲线
Fig.3 Cr6+ concentration gradient growth curves
耐重金属锰菌株XMn-1的生长曲线如图4所示。在0～4 h内，细菌的质量浓度缓慢升高，细菌处于延缓期，细菌在4～16 h细菌的数量迅速增多，细菌处于对数期，在20 h之后细菌的数量会有所下降，细菌处于衰亡期。在重金属锰离子的胁迫下，并不是锰离子质量浓度越高细菌生长受到抑制，在100 mg/L的锰离子培养液中，细菌的生长反而比0 mg/L的细菌生长状态要好，因此可以断定，当Mn2+质量浓度为0～100 mg/L时，细菌的质量浓度会随着锰离子质量浓度的增大而增大，锰离子对细菌的增殖起到了促进作用。当Mn2+质量浓度达到200 mg/L时，细菌的生长曲线斜率小于0 mg/L的培养液的细菌，可见重金属锰离子的质量浓度达到200 mg/L时，细菌的生长就会受到抑制，且Mn2+质量浓度越大抑制作用越明显。综上，该菌株在Mn2+质量浓度为100 mg/L时，会促进细菌的增殖，当Mn2+质量浓度高于200 mg/L时，会抑制细菌的增殖。
图4 耐重金属锰质量浓度梯度细菌生长曲线
Fig.4 Mn2+ concentration gradient growth curves
2.3 菌株的鉴定
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，20 min后进行凝胶成像分析(图5)，扩增片段大小约在1 500 bp，条带清晰。
图5 细菌DNA电泳
Fig.5 Bacterial DNA electrophoresis
耐重金属细菌16s rDNA基因序列与GenBank数据库中的对比序列相似度均在99%以上(除XMn-1菌株以外，相似度仅为85.37%)，序列的分析结果见表2。4种细菌分别为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、短杆菌属(Brevibacterium)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)，XMn-1与巨大芽孢杆菌基因序列相似度为85.37%，属芽孢杆菌属，可能为新种。
表2 耐重金属细菌16s rDNA基因序列分析结果
Table 2 Sequence analysis of heavy metal resistant bacteria 16s rDNA
菌株编号拉丁名中文名GenBank登录号相似度/%XCu-1Bacillus cereus蜡样芽胞杆菌EU857430.198.29XFe-1Bacillus toyonensis蜡状芽孢杆菌KY393017.198.00XCr-1Brevibacterium sp.短杆菌属MG309358.198.95XMn-1Bacillus 芽孢杆菌属 GU188935.185.37
利用MEGA 7软件，将4株耐重金属菌株的16s rDNA基因序列采用Neighbor-Joining构建系统进化树，。选取GenBank对比序列相似度高于98%的两个菌株序列，根据分子生物学原理，序列相似度高于96%就可以认为是同一个种(图6)。
图6 耐重金属细菌系统发育树
Fig.6 Phylogenetic trees of bacteria resistant to heavy metals
耐重金属细菌分子鉴定结果显示，耐重金属细菌XCu-1为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，刘海燕[26]研究发现从废弃重金属水中分离出的耐重金属铜细菌也包括芽孢杆菌，与本研究结果基本一致，芽孢杆菌具有耐铜特性。董新姣[27]从电镀厂废水污泥中分离到一株高耐铜的菌株，它能耐受Cu2+的最高质量浓度为560 mg/L,通过形态学观察及生理生化特性测定，初步鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，由此可知，除芽孢杆菌外，假单胞菌也具有耐铜特性。XCr-1属于短杆菌属(Brevibacterium)，此前舒彩云[28]、石青[29]研究发现短杆菌具有耐盐、耐寒等特性，关于耐重金属性还未有报道，可见短杆菌属是一种具有多种抗逆性菌株。XFe-1为蜡状芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)，周明[30]研究发现蜡状芽孢杆菌为一种石油降解菌，可以有效的降解石油原油。石油中含有大量重金属，微生物石油污染修复具有高效、无二次污染和经济的特点，受到研究者的高度重视[31]，因此菌株也可用降解石油中的重金属，石油中含有大量重金属铁，蜡状芽孢杆菌对石油中的重金属铁可能具有降解作用，这与本文的研究结果相似。
XMn-1菌株经过NCBI基因序列比对，与最高相似度的巨大芽孢杆菌仅为85.37%，为未知种。
本研究筛选出的细菌为耐受性细菌，但是否对重金属具有富集作用或者迁移作用还未曾考证，有待进一步设计实验。
本研究筛选出4株耐受重金属铁、锰、铜、铬细菌，对这些来源于矿区土壤的能在一定的重金属污染环境下生存的细菌菌株，进一步扩大培养并开展应用研究，可为改善矿区土壤重金属污染提供菌种资源和理论依据。
3 结 语
从宝日希勒矿区土壤中获得了4株耐4种重金属细菌菌株;其中3株为芽孢杆菌属，分别为蜡样芽胞杆菌，蜡状芽孢杆菌，和1株与巨大芽孢杆菌最高相似度仅为85.37%的极耐锰菌株，该菌株为未知种，另外1株为短杆菌属细菌。筛选到的菌株对重金属具有一定的耐受力，为未来矿区土地复垦和微生物生态修复提供理论依据和菌种资源。
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